遺伝的要因による疾患

遺伝子クローニング

　２００４年12月に発表されたヒトゲノム計画によると、ヒトの遺伝子の総数は約２万２０００と推定されています。ヒトの細胞からＤＮＡを取り出すことは簡単ですが、そのなかのひとつの遺伝子のはたらきを明らかにするには、そのままでは何もできません。目的とする遺伝子をもっているＤＮＡの断片を分離して、しかも増幅するというステップが必要です。

　これが遺伝子クローニングという方法で、これには細胞内で増殖できるＤＮＡであるベクターを用います。ＤＮＡを制限酵素で小さな断片に切り分け、ベクターに連結して宿主となる細胞にもどしてやります。この段階で目的の遺伝子を含むＤＮＡの断片は、他の大部分の不要なＤＮＡから分離されます。

　次に組み換えＤＮＡをもつ宿主細胞（組み換え体）を増殖させると、目的のＤＮＡも増幅できます。細菌などでは、アミノ酸配列の情報をもつ構造遺伝子はひとつながりのＤＮＡです。そのためベクターに結合して適当な宿主の細胞にもどしてやれば、遺伝子がｍＲＮＡをつくって蛋白質が生産されるので、目的の遺伝子がクローニングできたかどうかは比較的簡単にわかります。

　しかし、ヒトなどの遺伝子にはアミノ酸配列の情報をもたないイントロンがあるので、全体として大きいこと、またエクソンが分断されていることが遺伝子クローニングには障害になります。そこで、エクソンを含むＤＮＡ断片をベクターを用いてクローニングしてから、ｍＲＮＡに対応するＤＮＡをもつ組み換え体を選択するというような手段が用いられています。

　また、完成したｍＲＮＡはイントロンを含まないので、ｍＲＮＡからそれに対応するＤＮＡ（相補的ＤＮＡ：ｃＤＮＡ）を酵素を用いて合成してクローニングするという方法も用いられています。目的の遺伝子のｃＤＮＡが分離できれば、それを調べて遺伝子がつくる蛋白質のアミノ酸配列を決定できます。

　ヒトなどの高等生物の遺伝子クローニングでは、このようにＤＮＡから直接的にという方法と、ｍＲＮＡから間接的にという方法がとられていて、両方の研究から遺伝子の全体像が明らかにされています。

遺伝子増幅（ＰＣＲ）

　遺伝子がクローニングできると、そのＤＮＡのもつ遺伝情報であるヌクレオチド配列を決定するのは比較的簡単です。ヌクレオチド配列がわかればＰＣＲという方法で特定のＤＮＡの部分だけを増幅して調べることができます。

　ＰＣＲには２種類の20〜30ヌクレオチドの長さの合成ＤＮＡ（プライマー）が必要です。配列のわかっている２本鎖ＤＮＡのそれぞれのヌクレオチド配列と同じ配列をもつプライマーを、増幅したいＤＮＡ部分の両端に設定します。温泉などに生息する耐熱性細菌から取り出したＤＮＡポリメラーゼは、１００℃近い温度でも長時間安定してＤＮＡを複製することができます。

　細胞から取り出した鋳型になるＤＮＡと、２つのプライマーと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを試験管のなかに入れ、温度と時間をコントロールできる器械にセットします。たとえば94℃で30秒温度を加えると、鋳型として入れたＤＮＡは水素結合が切断され１本鎖に分かれます。55℃に冷やすとプライマーは対応する鋳型ＤＮＡと水素結合して部分的に２本鎖構造をとります。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの反応に適した72℃に温度を上げると、プライマーの結合した場所からＤＮＡの合成が始まります。この94℃、55℃、72℃のサイクルを30回繰り返すと、目的のＤＮＡ部分だけが数億倍に増幅します。

　遺伝子クローニングという複雑な方法をとらなくても、目的のＤＮＡだけを微量な鋳型ＤＮＡから増幅して分離できるのがＰＣＲです。たとえばがん組織の一部から鋳型となるＤＮＡを取り出し、ＰＣＲでがんの原因になる遺伝子を増幅してそのヌクレオチド配列を決定し、その遺伝子のなかに起こっている突然変異を見つけるというようなことができることになります。

　遺伝病の原因遺伝子だけでなくさまざまな病気の原因になる遺伝子の突然変異を調べるという遺伝子診断なども、このＰＣＲという方法が可能にしています。

（兵庫医科大学遺伝学教育教授　山本義弘）